作者：唐戎成敏聶永梅陳槐卿
機構地區(qū)：四川大學華西醫(yī)學中心生物醫(yī)學工程實驗室，成都610041
出處：《生物醫(yī)學工程學雜志》
核心刊IC CAS CSA JST AJ PUBMED CSA-PROQEUSTSCOPUS ZGKJHX CSCD
2004年第3期363-366，共4頁
摘要：
血管內(nèi)皮細胞襯于血管腔的表面，是血流機械應力的主要感受者。切應力可以直接調節(jié)內(nèi)皮細胞生物活性物質的合成和分泌，其中包括誘導內(nèi)皮細胞生成IL-8，而且IL-8的生成量與切應力作用時間有關。為闡明內(nèi)皮細胞IL-8的生成除了與切應力的作用時間有關外還與切應力的強度有關，我們用不同強度的流體切應力(2．09、4．61、6．19、8．51、10．50、12．59、14．41、17．22、18．32dyne／cm2)處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，然后采用雙抗體夾心ABC-ELISA技術檢測內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質的生成。
結果顯示：未用切應力處理的內(nèi)皮細胞只有極少量的IL-8蛋白質生成；切應力處理內(nèi)皮細胞后，低切應力(2．09dyne／cm2)時IL-8蛋白質生成量明顯增加，約為高切應力(18．32dyne／cm2)時IL-8蛋白質生成量6(作用5h)7倍(作用6h)。IL-8蛋白質生成量與內(nèi)皮細胞所施加的切應力強度呈反變關系；直線回歸方程：5h時為y=760．12-36．06x，相關系數(shù)7=-0．978；6h時為y=781．87-36．66x，相關系數(shù)7=-0．980。
式中：
y為切應力作用下內(nèi)皮細胞IL-8的生成量；
x為施加于內(nèi)皮細胞的切應力強度(dyne／cm2)。
不同的切應力作用時間(5h、6h)均表現(xiàn)出相同的IL-8蛋白質生成量隨切應力強度的變化規(guī)律。
提示流體切應力誘導內(nèi)皮細胞生成IL-8的量，不僅與切應力的作用時間有關，而且IL-8的生成量與切應力強度有關。流體低切應力誘導內(nèi)皮細胞IL-8的生成量急劇增高，可能在急性炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。
1前言
血管內(nèi)皮細胞(Endothelial cells，ECs)襯于血管腔的內(nèi)表面，是血流與血管壁相互作用的界面，是血流機械應力的主要感受者和信號傳導者。血管內(nèi)皮細胞所受到的機械應力一般分為3種：血流的剪切應力、血管壁的周向應力和血流的法向應力。其中血流的剪切應力通過血管內(nèi)皮細胞切應力感受器傳遞和轉導力學信號，調節(jié)著內(nèi)皮細胞的結構和功能。目前已發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞在流體切應力作用下可以表達多種趨化性細胞因子，如單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactie protein 1，MCP-1)、生長調節(jié)癌基因(Growth regulated oncogene，GRO)、白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)等，并證實力學刺激通過調節(jié)血管內(nèi)皮細胞表達IL-8來參與炎癥性疾病和動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展和預后過程。流體切應力作用于內(nèi)皮細胞不僅可以誘導生成IL-8，而且IL-8蛋白質的生成與切應力的作用時間有關。但內(nèi)皮細胞在切應力作用下IL-8蛋白質的生成量是否與切應力強度有關，國內(nèi)外尚未見報道。因此，本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA技術來研究流體切應力的強度對培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)IL-8蛋白質生成的影響，以期了解流體切應力的強度是否也能影響內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質的生成以及其強度依賴性的變化規(guī)律。
2材料與方法
2．1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定
根據(jù)Jaffe等的方法，本室加以改進。培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞在相差顯微鏡下呈多角形、單層鋪路石狀排列。透射電鏡下，胞漿內(nèi)有Weibel-Palade小體。免疫組織化學染色可見Ⅶ因子相關抗原陽性。
2．2流室系統(tǒng)
由一塊有機玻璃平板和一塊玻璃蓋板組成。兩塊板之間有環(huán)形硅橡膠墊圈，可防滲漏。安裝后的流室的尺寸為：長8．5cm，寬2．5cm，高0．3mm。流入孔和流出孔間距離為7．0cm。經(jīng)理論計算，流室測試區(qū)滿足：
(1)層流；
(2)二維流動；
(3)充分發(fā)展流動。
2．3切應力處理內(nèi)皮細胞
將傳至2～4代的內(nèi)皮細胞接種到載玻片(7、5cm×2．5 cm)上，待長滿匯合后轉移到流室的測試區(qū)。密封后進行流體剪切實驗，由Model 7518-10型蠕動泵(ColeParmer公司，美國)為實驗中的灌流系統(tǒng)提供穩(wěn)定的定常流(Sready flow)，分別選取2．09、4．61、6．19、8．51、10．50、12．59、14．41、17．22、18．32dyne/cm2的切應力處理內(nèi)皮細胞。處理時間分別為5h和6h。以未做任何處理的內(nèi)皮細胞做為對照。實驗時流室內(nèi)保持37±1℃，培養(yǎng)液中的緩沖體系可維持pH值在7．2～7．4之間。整個灌流系統(tǒng)處于同一水平面。實驗結束后收集培養(yǎng)液，-20℃保存待測。
2．4 IL-8含量的測定
用人IL-8定量EIASA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測培養(yǎng)液中的IL-8含量：將待測液(100μl)依次加入鼠抗人IL-8單抗包被的96孔微孔板，37℃孵育2 h后洗板；加入辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)多抗(50μl)，37℃孵育1h后洗板；加入100μl底物工作液，置37℃顯色5～10min；加入50μl 2 mol/lH2SO4終止反應，在492nm處測吸光值，根據(jù)標準曲線計算IL-8蛋白質濃度。
3結果
靜態(tài)培養(yǎng)的HUVECIL-8蛋白質有低水平的基礎表達，表達量在5．674±0．851～6．398±0．634pg/ml之間；當流體切應力作用時間為5h，切應力強度分別為2．09、4．61、6．19、8．51、10．50、12．59、14．41、17．22、18．32dyne/cm2時，IL-8蛋白質生成量明顯增加，分別為684．045±5．334、495．346±8．532、475．547±3．366、446．043±5．633、297．356±5．323、209．083±8．552、141．851±0．562、98．469±0．662、99．5±0．965pg/ml；當流體切應力作用時間為6h，相同切應力條件下IL-8蛋白質生成量進一步增加，分別為694．727±5．122、508．090土8．333、486．043±6．546、455．882±8．963、307．557±6．582、218．336±3．342、149．947±6．563、101．5±0．956、100．26±0．556 pg/ml。切應力為2．09dyne/cm2時，IL-8蛋白質生成量高，約為切應力18．32dyne/cm2時IL-8蛋白質生成量的6～7倍，IL-8蛋白質的生成量與施加于內(nèi)皮細胞的切應力強度呈反變關系。經(jīng)用SPSS10．0統(tǒng)計軟件對切應力強度及其對應的IL-8蛋白質生成量進行回歸與相關分析，按α＝0．05水平拒絕無效假設。切應力強度與對應的IL-8蛋白質生成量之間的直線回歸方程為：
y＝760．12-36．06x，相關系數(shù)r＝-0．978(5h)
y=781．87-36．66x，相關系數(shù)r＝-0．980(6h)
式中：y為切應力作用下內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質生成量(pg/ml)；
x為施加于內(nèi)皮細胞的切應力強度(dyne/cm2)。
對直線回歸和相關系數(shù)分別進行假設檢驗，均為p<0．05，具有統(tǒng)計學意義(見圖1)。
4討論
4．1切應力強度影響內(nèi)皮細胞IL-8的生成
內(nèi)皮細胞在其整個生命活動過程中始終受到血管中的血流機械應力作用。在長期的力學環(huán)境中，內(nèi)皮細胞獲得了對力的類型、大小敏感的機制。內(nèi)皮細胞能夠感知所處環(huán)境中力學因素的變化，并做出形態(tài)、結構和功能上的調整以適應力學環(huán)境的改變。
本實驗室張文勝等發(fā)現(xiàn)流體切應力可以誘導內(nèi)皮細胞表達IL-8基因，而且IL-8mRNA的表達量與切應力的作用強度有關，呈反變關系，但IL-8蛋白質的表達量與切應力的作用強度是否有關，仍是需要進一步研究的問題。因為眾所周知，蛋白質才是生命功能的真的執(zhí)行者。以往的研究發(fā)現(xiàn)在層流切應力作用下，切應力誘導內(nèi)皮細胞趨化性細胞因子的合成和分泌具有強度和時間依賴性。如Yu等報道4dyne/cm2的切應力作用內(nèi)皮細胞MCP-1蛋白質的生成量比10dyne/cm2組明顯增高，邢海燕等報道0．72dyne/cm2的切應力作用內(nèi)皮細胞5h MCP-1蛋白質的生成量比2．4dyne/cm2組明顯增高，這與我們的結果是一致的。本研究也發(fā)現(xiàn)低切應力時內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質的生成量較高，而在高切應力時IL-8蛋白質的生成量較低。IL-8蛋白質的生成量與切應力強度呈反變關系，低切應力通過什么機制誘導了內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質的合成和分泌?高切應力又通過什么機制抑制了內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質的合成和分泌?這些都是非常有趣和值得深入探討的問題。
4．2不同強度切應力影響內(nèi)皮細胞IL-8生成的臨床意義
臨床上發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊好發(fā)生在動脈的分枝開口處和彎曲動脈的凸面，特別是動脈分叉處的外側壁。這往往是血流方向紊亂和低切應力區(qū)域(≤4dyne/cm2)，大大低于其他直通的血管區(qū)域(≥15dyne/cm2)。當切應力≥15dyne/cm2時，可以誘導內(nèi)皮細胞NO的釋放，刺激組織纖溶酶原激活物的表達，并減少其抑制物的表達，阻止內(nèi)皮細胞凋亡；減少內(nèi)皮細胞受損后炎癥前細胞因子的激活；抑制平滑肌細胞的遷移，抑制內(nèi)皮細胞趨化性細胞因子、黏附分子等的表達；誘導內(nèi)皮細胞抗粥樣硬化基因的表達。因而具有抗動脈粥樣硬化作用。而低切應力(≤4dyne/cm2)對內(nèi)皮細胞的調節(jié)作用正與此相反，促進內(nèi)皮細胞增生、白細胞黏附，因而具有促動脈粥樣硬化作用。另外臨床上急性炎癥往往伴有劇烈的血流動力學變化。切應力對炎癥反應有調節(jié)作用，例如切應力使內(nèi)皮細胞細胞間黏附分子-1(Intracellular adhesionmolecule-1，ICAM-1)的表達上調，增加白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附；生理范圍的切應力使中性粒細胞出現(xiàn)聚集，在聚集細胞的接觸部位F-肌動蛋白聚合化，并伴有細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。低切應力區(qū)域，如我們實驗中所用的2．09dyne/cm2(相當于微靜脈水平，2．10dyne/cm2)、4．61dyne/cm2(相當于毛細血管后靜脈水平，4．60dyne/cm2)、6．19dyne/cm2(相當于小靜脈水平，6．10dyne/cm2)，這正是急性炎癥時中性粒細胞滲出血管并向炎癥中心趨化的部位。在切應力的作用下，內(nèi)皮細胞分泌IL-8。IL-8激活中性粒細胞運動裝置，使其定向游走(趨化作用)；促使其表達黏附分子；刺激中性粒細胞脫顆粒和呼吸爆發(fā)，促進溶酶體酶釋放；促使胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，使胞漿的48KDa蛋白磷酸化，在切應力和其它因素的共同作用下，形成了急性炎癥時復雜的病理生理變化。我們認為低切應力可能是通過IL-8來介導急性炎癥發(fā)展過程的。另外，在動脈的分枝開口處和彎曲動脈的凸面等低切應力區(qū)域，切應力誘導內(nèi)皮細胞表達IL-8，IL-8趨化單核細胞和淋巴細胞到該部位，并同時介導單核細胞在內(nèi)皮細胞上的滾動和牢固黏附，可能是動脈粥樣硬化作用的始動因素之一。而在高切應力(17．22、18．32dyne/cm2)時IL-8的生成量明顯降低，則可能具有抗動脈粥樣硬化的作用。